Причина гибели микроорганизмов при воздействии ионизирующего излучения. Влияние физических и химических факторов на микроорганизмы. Как радиация вредит клетке

Биологи называют бактерии эволюционным рецептом успеха - настолько они устойчивы к любым условиям внешней среды. Некоторые из них прекрасно себя чувствуют даже при смертельных дозах радиации.

Микробиолог Джон Батиста из Университета Луизианы повидал немало. Однако о своей первой встрече с микробом, в шутку прозванным «Конан-супербактерия», он сказал: «Честное слово, мне было нелегко поверить в реальность существования подобного организма».

В начале 1960-х годов Томас Брок обнаружил в Йеллоустонском национальном парке бактерии, выдерживавшие температуры, близкие к точке кипения. После этого микробиологи стали находить всё новые виды микробов экстремалов. Однако Конан превзошел всех: самый устойчивый микроорганизм, он выдерживает трескучий мороз, испепеляющую жару, кислотные ванны и яды. Но поразительней всего была его реакция на высокие дозы радиоактивного облучения. Даже 1500-кратное превышение дозы, смертельной для прочих организмов, не приносило бактерии никакого вреда.

Впервые Конан был обнаружен в 1950-х годах в испорченных мясных консервах, предназначавшихся для армии. Для защиты от заражения бактериями консервы в США обычно стерилизуют с помощью радиоактивного излучения. Тем сильнее удивились ученые, когда увидели в банках розовую плесень с запахом гнилой капусты, явно бактериального происхождения. Они были озадачены. Ведь обычно радиация вызывает в живых организмах глубокие повреждения генетического материала. Если количество таких повреждений превысит некий критический уровень, микроорганизм погибает. Но для Конана закон не писан. Какие же механизмы спасают невзрачную кроху от смерти в любой ситуации?

Поставленные в тупик микробиологи занялись разгадкой тайны Конана. Они исследовали его генетический материал до и после воздействия радиации и проанализировали обменные процессы. К их удивлению, результаты свидетельствовали, что Конан тоже сильно страдает от радиации, но при этом умеет преодолевать ее гибельные последствия.

Если некоторые яды или ионизирующее излучение наносят сравнительно незначительный вред лишь одной из двух нитей ДНК организма, то радиоактивное излучение вызывает повреждение обеих нитей ДНК, а их восстановление часто бывает непосильным для организма. Так, для гибели живущей в кишечнике человека кишечной палочки достаточно двух-трех таких повреждений ДНК.

Конан же, напротив, быстро восстанавливал две сотни подобных «поломок». Дело в том, что в процессе эволюции у него выработались эффективные механизмы восстановления генных повреждений - в том числе появился особый фермент, который отыскивает подходящие «запчасти» в наследственном материале, копирует их и вставляет в поврежденные участки.

Восстановлению ДНК у Конана способствует еще одно обстоятельство: геном Конана состоит из четырех кольцевых молекул ДНК, причем в каждой клетке геном присутствует не в одной, как у большинства бактерий, а в нескольких копиях. Именно благодаря этим копиям и происходит восстановление поврежденных участков. Поскольку клетка наиболее уязвима для радиации в момент деления, когда кольцевая молекула ДНК должна разомкнуться, Конан выработал еще один способ защиты: три молекулы бактерия оставляет свернутыми в кольцо, а четвертую использует для нужд воспроизведения. Если под воздействием радиации эта хромосома получает повреждения, запасные хромосомы служат матрицами, с которых организм копирует правильные последовательности генов.

В 2007 г. микробиолог Майкл Дж. Дейли обнаружил еще одну причину гиперстойкости Конана: эта бактерия отличается невероятно высокой внутриклеточной концентрацией марганца -элемента, который также способствует восстановлению повреждений ДНК.

И все же, несмотря на сделанные открытия, загадка сверхустойчивости Конана к радиации до конца еще не разгадана. Исследования идут полным ходом: ученые надеются эффективно использовать Конана для очистки почв, загрязненных радиацией.

Ближний ультрафиолет (УФ) - излучение с длиной волны 400 - 320 нм - даже в невысоких дозах оказывает на бактерий определенное действие. Так, при освещении ближним УФ подвижных клеток Е. coli или Salmonella typhimurium сначала наблюдается увеличение частоты кувырканий клеток, т.е. репеллентный эффект, затем кувыркания полностью прекращаются и наступает паралич жгутиков, т.е. свет нарушает механизмы движения и таксиса. При этом хромофором является флавопротеин.

В сублетальных дозах ближний УФ вызывает замедление роста культур, главным образом за счет удлинения лаг-фазы. Скорость деления клеток также несколько снижается, подавляется способность бактерий поддерживать развитие фага и угнетается индукция ферментов. Эти эффекты определяются в основном поглощением УФ-лучей 4-тиоуридином - необычным основанием, присутствующим в 8-й позиции у многих тРНК прокариот (но не у эукариот). Наибольший эффект оказывает свет длиной волны около 340 нм. Возбужденный светом 4-гиоуредин образует сшивки с цитозином, находящимся в 13-м положении в тРНК, что препятствует связыванию тРНК с аминокислотами и приводит к увеличению образования гуанозинтрифосфата на рибосомах и к приостановке синтеза РНК и белка соответственно. У Bacillus subtillis обнаружена и другая чувствительная к ближнему УФ-система, у которой воспринимающим свет хромофором является менахинон.

При относительно высоких дозах облучения ближним УФ наблюдаются мутагенные и летальные эффекты. Нарушение ДНК вызывают не столько сами УФ-лучи, сколько различные другие возбужденные светом молекулы. И в этих эффектах имеет значение поглощение ближнего УФ 4- тиоуредином. Мутагенное и летальное действие ближнего УФ в значительной степени зависит от присутствия кислорода.

Летальный эффект при облучении ближним УФ может быть связан с повреждением не только ДНК, но и мембран, в частности их транспортных систем. Чувствительность к ближнему УФ бактерии может сильно зависеть от стадии роста культуры, что не наблюдается при действии дальнего УФ.

Эффект действия ближнего УФ может быть опосредован фотосенсибилизатором. Так, в присутствии акридина у E.coli ближний УФ вызывает нарушение как ДНК, так и внешней цитоплазматической мембран, в результате чего клетки становятся чувствительными к лизоциму, детергентам, осмотическому шоку.

Ближний УФ может при невысоких дозах облучения вызывать фотопроекцию, т.е. снижать биологический эффект последующего облучения дальним УФ. Представление о механизме этого эффекта противоречивы. При относительно высоких дозах облучения ближним УФ может наблюдаться и противоположный эффект, т.е. усиление действия последующего облучения дальним УФ.

Средний УФ - это излучение с длиной волны 320 - 290 нм, и дальний УФ - с длиной волны 290 - 200 нм. Биологические эффекты действия среднего и дальнего УФ сходны. Как уже упоминалось, при облучении солнечным светом гибель бактерий связана в основном с действием УФ. Нижний предел длины волны света, попадающего на земную поверхность, составляет около 290 нм, в исследованиях же используют источники света с меньшей длиной волны. Считают, что резистентность организма к солнечной радиации, как правило, соответствует его устойчивости к неионизирующему излучению от искусственных источников.

ДНК интенсивно поглощает УФ в области 240 - 300 нм, т.е. в области среднего и дальнего УФ, с пиком поглощения в области 254 нм. Этим объясняется высокая мутагенная и летальная эффективность облучения средним и дальним УФ. Образование пиримидиновых димеров в ДНК является основным механизмом, обусловливающим летальный и мутагенный эффекты. В состав димеров могут входить 2 соседних тиминовых или цитозиновых остатка либо 1 тиминовый и 1 цитозиновый остатки. Под влиянием УФ-облучения происходит также гидроксилирование цитозина и урацила, образование цитозин-тиминовых аддуктов, сшивок ДНК с белком, формирование поперечных сшивок ДНК, разрывы цепей и денатурация ДНК. Такие повреждения возрастают при повышении интенсивности облучения.

Ионизирующее излучение составляет определенный компонент естественной радиации, определяемый нестабильными изотопами, постоянно находящимися в почве и атмосферных осадках. В областях залегания радиоактивных минералов естественный фон радиации повышен. Изотопы могут попадать в живые организмы и тогда они подвергаются внутреннему облучению. Бактерии иногда способны накапливать некоторые элементы в очень больших количествах.

Ионизирующее излучение возникает также под влиянием космических лучей. Космическое пространство служит источником первичных космических лучей, которые дают начало вторичным, воздействующим на живые организмы. Интенсивность такого излучения зависит от географической широты, особенно от высоты над уровнем моря, и приблизительно удваивается каждые 1500 м. В период солнечных вспышек фон космической радиации повышен. Искусственное ионизирующее излучение возникает в результате испытаний ядерного оружия, работы АЭС, применения радиоизотопов в медицинских, научных и других целях. Наличие таких источников - причина того, что микроорганизмы в наши дни подвергаются высоким дозам облучения.

Ионизирующие излучения также вызывают повреждения ДНК, которые принято подразделять на прямые и опосредованные, возникающие в связи с образованием свободных радикалов. Повреждения преимущественно представляют собой одноцепочечные или двухцепочечные разрывы молекулы ДНК.

Радиорезистентность различных бактерий варьирует в очень широких пределах и контролируется многими генами. Сравнительно легко могут быть получены мутанты, более радиорезистентные или радиочувствительные. Радиорезистентность зависит прежде всего от работы различных систем репарации и регуляции. При этом степени устойчивости организма к излучениям различных типов, особенно УФ и ионизирующим излучениям, могут не совпадать. Различные репарационные системы бактерий будут рассмотрены ниже.

Установлена связь радиоустойчивости бактерий с особенностями ее местообитания. Так, микроорганизмы, выделенные из радоновых минеральных источников, оказываются в 3 - 10 раз более резистентными к радиации, чем организмы тех же видов, выделенные из нерадиоактивной воды. В охладительных системах ядерных реакторов, где средняя доза излучения превышает 10 6 ФЭР (физический эквивалент рентгена), обитают разные бактерии, в частности представители рода Pseudomonas. Однако в основном трудно найти разумное объяснение адаптационного значения высокой радиоустойчивости некоторых бактерий. Особенно высока радиоустойчивость некоторых кокков, выделенных из облученных продуктов. В данном случае очевидно, что облучение могло служить фактором отбора, но не фактором, вызвавшим адаптацию. Так, доза УФ, необходимая для инактивации 90% клеток УФ-резистентного штамма Е. coli, составляет около 1000 эрг/мм “ 2 , в то время как для достижения такого же эффекта у Deinococcus radiodurans требуется доза в 10000 - 15000 эрг/мм" 2 или 5 х 10 5 рад в случае радиоактивного облучения. Еще большей устойчивостью к УФ- и у-излучению обладает кокк Deinococcus radiophilus. Как уже упоминалось, уровень радиорезистентности определяется главным образом степенью развитости репарационных систем. Deinococcus radiodurans, видимо, способен репарировать даже двухнитевые разрывы ДНК, летальные для большинства микроорганизмов.

Степень радиоустойчивости некоторых бактерий значительно превышает предельный уровень радиации, с которым организмы могут сталкиваться в природе. Наиболее вероятным объяснением этого несоответствия может быть предположение о том, что радиоустойчивость - лишь одно из многообразных проявлений действия систем широкого назначения. Правильнее было бы говорить о степени устойчивости бактерий к определенным нарушениям в структуре их клеток, чем об устойчивости к воздействию определенных факторов среды, поскольку одинаковые нарушения могут быть вызваны разными причинами. Это относится прежде всего к системам репарации повреждений ДНК.

Радиационная микробиология - это отрасль микробиологии, изучающая действие ультрафиолетового и ионизирующего излучений на микроорганизмы. Исследования в области радиационной микробиологии имеют целью: 1) изучение механизмов биологического действия ультрафиолетового и ионизирующих излучений на микроорганизмы; 2) использование радиации как фактора, вызывающего наследственную изменчивость или гибель бактерий.

Микроорганизмы служат широко используемым объектом радиобиологических экспериментов для исследования общих закономерностей действия излучений на клетку. В этой области радиационная микробиология непосредственно смыкается с радиобиологией (см.). Радиационная микробиология решает вместе с тем важные практические задачи, имеющие народнохозяйственное значение, например применение излучений как фактора переделки природы микроорганизмов с целью получения больших выходов биологически ценных веществ (антибиотиков, витаминов, гормонов, аминокислот). На стерилизующем эффекте излучений основан метод «холодной» стерилизации (см.), которая часто имеет преимущества перед стерилизацией теплом или антисептиками, а иногда оказывается единственно возможной.

Действие ионизирующей радиации на наследственность было впервые обнаружено в опытах на микроорганизмах. В 1925 г. Г. А. Надсон и Г. С. Филиппов обнаружили, что под влиянием рентгеновского излучения у микроорганизмов возникают изменения, стойко сохраняющиеся в последующих поколениях (мутации). Это наблюдение положило начало развитию новой отрасли знаний - радиационной генетике (см.). Радиационная микробиология учитывает вскрытые этой наукой закономерности, в частности то, что в определенном диапазоне доз излучения количество мутантных форм увеличивается пропорционально дозе. При помощи ионизирующей радиации естественная частота мутационного процесса может быть увеличена в десятки раз. При этом, конечно, увеличивается выход самых разнообразных наследственно измененных вариантов, затрагивающих различные наследуемые признаки микроорганизмов. Именно поэтому само по себе облучение без последующей селекции не может служить способом получения измененных в желаемом направлении форм микроорганизмов. Облучение лишь обеспечивает появление в микробной популяции большего числа вариантов с наследственными изменениями. Последующая селекция по интересующему признаку позволяет быстрее и с большей вероятностью успеха отобрать необходимый для тех или иных нужд вариант. Так, например, селекция штаммов-продуцентов пенициллина Penicillium chrysogenum с предварительным воздействием рентгеновского и ультрафиолетового излучений позволила американским микробиологам отобрать варианты с продуктивностью, более чем в 100 раз превышающей выработку пенициллина исходным штаммом. Использование мутантов, индуцированных нейтронами, - рентгеновским и ультрафиолетовым излучениями или химическими мутагенами, в 15-30 раз повысило продуктивность штаммов-продуцентов стрептомицина, хлортетрациклина, окситетрациклина. Ведутся работы по радиационной селекции других важных в производственном отношении штаммов микроорганизмов (вакцинных, токсигенных, продуцентов аминокислот и т. п.).

Проблемы радиационной микробиологии, относящиеся к использованию стерилизующего действия радиации, прежде всего связаны с определением доз радиации и условий облучения, обеспечивающих гибель микроорганизмов. Бактерицидное действие рентгеновых лучей было известно уже в конце прошлого столетия. Однако практическое использование ионизирующих излучений для целей стерилизации стало возможным только в последние годы благодаря созданию мощных облучателей, в частности гамма-облучателей, заряженных радиоактивным кобальтом. Современные гамма-облучатели дают возможность обеспечивать огромные дозы радиации в короткое время и в больших объемах облучаемого объекта. Необходимость в создании установок большой мощности для целей стерилизации объясняется относительно высокой радиорезистентностью микроорганизмов. Если для млекопитающих летальные дозы облучения колеблются в пределах 400-1000 рад, то инактивация микробов в зависимости от условий облучения происходит только при использовании доз порядка сотен тысяч или миллионов рад.

Бактерицидное действие ионизирующих излучений зависит от ряда факторов. Высушивание микроорганизмов приводит к повышению радиорезистентности. Аналогичное действие оказывают уменьшение парциального давления кислорода в облучаемом объекте, понижение температуры во время облучения, а также условия, создаваемые после облучения. В случаях облучения микробных культур чувствительность микроорганизмов меняется в зависимости от цикла развития культуры.

Различные микроорганизмы обладают различной радиорезистентностью. Так, например, для достижения стерилизующего эффекта при облучении взвесей неспорообразующих бактерий (Bact. coli, Proteus vulgaris) необходимо облучение в дозах 100 000-500 000 рад. Для инактивации спор спорообразующих микроорганизмов необходимы большие дозы - 1 500 000-2 500 000 рад.- Еще более устойчивы вирусы: стерилизующий эффект наступает только при облучениях в дозах 3 000 000- 5 000 000 рад.

Влияние физических факторов

Влияние температуры. Различные группы микроорганизмов развиваются при определенных диапазонах температур. Бактерии, растущие при низкой температуре, называют психрофилами, при средней (около 37 °С) - мезофилами, при высокой - термофилами.

К психрофильным микроорганизмам относится большая группа сапрофитов - обитателей почвы, морей, пресных водоемов и сточных вод (железобактерии, псевдомонады, светящиеся бактерии, бациллы). Некоторые из них могут вызывать порчу продуктов питания на холоде. Способностью расти при низких температурах обладают и некоторые патогенные бактерии (возбудитель псевдотуберкулеза размножается при температуре 4 °С). В зависимости от температуры культивирования свойства бактерий меняются. Интервал температур, при котором возможен рост психрофильных бактерий, колеблется от -10 до 40 °С, а температурный оптимум - от 15 до 40 °С, приближаясь к температурному оптимуму мезофильных бактерий.

Мезофилы включают основную группу патогенных и условно-патогенных бактерий. Они растут в диапазоне температур 10- 47 °С; оптимум роста для большинства из них 37 °С.

При более высоких температурах (от 40 до 90 °С) развиваются термофильные бактерии. На дне океана в горячих сульфидных водах живут бактерии, развивающиеся при температуре 250-300 °С и давлении 262 атм.

Термофилы обитают в горячих источниках, участвуют в процессах самонагревания навоза, зерна, сена. Наличие большого количества термофилов в почве свидетельствует о ее загрязненности навозом и компостом. Поскольку навоз наиболее богат термофилами, их рассматривают как показатель загрязненности почвы.

Хорошо выдерживают микроорганизмы действие низких температур. Поэтому их можно долго хранить в замороженном состоянии, в том числе при температуре жидкого газа (-173 °С).

Высушивание. Обезвоживание вызывает нарушение функций большинства микроорганизмов. Наиболее чувствительны к высушиванию патогенные микроорганизмы (возбудители гонореи, менингита, холеры, брюшного тифа, дизентерии и др.). Более устойчивыми являются микроорганизмы, защищенные слизью мокроты.

Высушивание под вакуумом из замороженного состояния - лиофилизацию - используют для продления жизнеспособности, консервирования микроорганизмов. Лиофилизированные культуры микроорганизмов и иммунобиологические препараты длительно (в течение нескольких лет) сохраняются, не изменяя своих первоначальных свойств.

Действие излучения

Неионизирующее излучение - ультрафиолетовые и инфракрасные лучи солнечного света, а также ионизирующее излучение - гамма-излучение радиоактивных веществ и электроны высоких энергий губительно действуют на микроорганизмы через короткий промежуток времени. УФ-лучи применяют для обеззараживания воздуха и различных предметов в больницах, родильных домах, микробиологических лабораториях. С этой целью используют бактерицидные лампы УФ-излучения с длиной волны 200-450 нм.

Ионизирующее излучение применяют для стерилизации одноразовой пластиковой микробиологической посуды, питательных сред, перевязочных материалов, лекарственных препаратов и др. Однако имеются бактерии, устойчивые к действию ионизирующих излучений, например Micrococcus radiodurans была выделена из ядерного реактора.

Действие химических веществ

Химические вещества могут оказывать различное действие на микроорганизмы: служить источниками питания; не оказывать какого-либо влияния; стимулировать или подавлять рост. Химические вещества, уничтожающие микроорганизмы в окружающей среде, называются дезинфицирующими. Антимикробные химические вещества могут обладать бактерицидным, вирулицидным, фунгицидным действием и т.д.

Химические вещества, используемые для дезинфекции, относятся к различным группам, среди которых наиболее широко представлены вещества, относящиеся к хлор-, йод- и бромсодержащим соединениям и окислителям.

Антимикробным действием обладают также кислоты и их соли (оксолиновая, салициловая, борная); щелочи (аммиак и его соли).

Стерилизация – предполагает полную инактивацию микробов в объектах, подвергшихся обработке.

Дезинфекция - процедура, предусматривающая обработку загрязненного микробами предмета с целью их уничтожения до такой степени, чтобы они не смогли вызвать инфекцию при использовании данного предмета. Как правило, при дезинфекции погибает большая часть микробов (в том числе все патогенные), однако споры и некоторые резистентные вирусы могут остаться в жизнеспособном состоянии.

Асептика – комплекс мер, направленных на предупреждение попадания возбудителя инфекции в рану, органы больного при операциях, лечебных и диагностических процедурах. Методы асептики применяют для борьбы с экзогенной инфекцией, источниками которой являются больные и бактерионосители.

Антисептика – совокупность мер, направленных на уничтожение микробов в ране, патологическом очаге или организме в целом, на предупреждение или ликвидацию воспалительного процесса.

Микроорганизмы, по чувствительности к радиационному действию, обычно располагают в таком порядке: - наиболее чувствительны бактерии, затем плесени, дрожжи, споры бактерий, вирусы. Однако это разделение не абсолютно, так как среди бактерий есть виды более радиоустойчивые, чем вирусы.

Радиочувствительность микроорганизмов модифицируют различные факторы, как внутренние: генетическая природа самой клетки, жизненная фаза клетки и другие, так и внешние: температура, концентрация кислорода и других газов, состав и свойства среды в которой производится облучение, а также тип радиационного воздействия и его мощность и другие факторы. Радиочувствительность микроорганизмов значительно ниже, чем у растений и животных на 1-2 порядка, в ряде случаев бактерицидный эффект для некоторых видов может быть достигнут только при значительных дозах: 1-2 Мрад.

Уже на первых этапах исследования радиационной чувствительности микроорганизмов было показано, что при дозе 5000 Р значительно снижается выживаемость кишечной палочки, а при дозе 20 кР погибает 95 % бактерий. Культура микроорганизмов каждого вида содержит смесь клеток, различных по чувствительности к радиации. Например для культуры кишечной палочки 66% LD50 соответствовала доза 1,2 крад, а для 34 % бактерий - 3,5 крад. При облучении бактерий кишечной группы гамма лучами, их инактивация происходит в пределах от 24 до 168 крад, а гибель всех клеток при дозах около 300 крад.

Для получения одинакового биологического эффекта у различных видов микроорганизмов требуются различные дозы излучения. Эти различия зависят от ряда биологических особенностей облучаемых бактерий, условий облучения, влияния внешней среды и других факторов. Особое значение придается неодинаковой чувствительности нуклеинового обмена и ДНК различных организмов к радиационному облучению.

Чувствительность бактерий к радиации значительно изменяется внутри одного и того же вида и, даже, популяции бактериальных клеток. Популяция клеток состоит из бактерий, располагающихся по устойчивости к радиации в вариационный ряд, так же, как и по другим биологическим признакам. Поэтому в популяции всегда присутствуют особо радиорезистентные клетки, для того, чтобы их убить, нужно облучать более мощными дозами, чем те, при которых погибает основная масса клеток более радиочувствительных. Грамположительные бактерии менее чувствительны к облучению, чем грамотрицательные.

Споры бактерий обладают очень низкой радиочувствительностью, но и среди неспорообразующих микроорганизмов известны организмы радиоустойчивость которых может превышать устойчивость спор. Чаще всего они принадлежат к кокам или сарцинам. Известны микрококки, у которых полулетальная доза равна 400 крад (4 кГр). При лучевой стерилизации мяса, рыбы и других продуктов наиболее часто после облучения в дозах от 600 до 1500 крад обнаруживали кокков. Примером высокой радиоустойчивости могут быть также бактерии, выделяемые из вод атомных реакторов.